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股票代码为（300404）创建于2002年，2015年在深圳创业板上市，是一家为国内外医药企业提供药品、保健品、医疗器械研发与生产全流程“一站式”外包服务(CRO)的型高新技术企业，同也提供药品上市许可持有人(MAH)服务。
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药品研发“一站式”服务包括：新药立项研究和活性筛选、药学研究(含中试生产)、药理毒理研究、临床用药与模拟剂的生产、临床试验、临床数据管理和统计分析、上市后再评价、技
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公司新闻
袁来如此 | 大分子生物分析概论（十四_上）：LBA定量分析双特异性生物药的挑战
作者：广州九游会J9医药 时间：2021-08-18 来源：广州九游会J9医药
     本文为系列文章《大分子生物分析概论》的第十四篇，旨在根据已发表的文献资料，初步的介绍定量分析双特异性抗体的LBA方法所面临的挑战。
 
     由于内容篇幅较长，本文将采取上下篇形式进行推送，敬请垂注！《袁来如此》专栏系广州九游会J9医药微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为九游会J9医药药物研究中心资深科学顾问袁智博士原创。

 
     与传统（单特异性）的生物药相比，双特异性生物药对其药代动力学（PK）的表征提出了独特的挑战。在此背景下，开发生物药的生物分析策略正在迅速演变，以支持这些不断变化的药物模式。


     一般说来，生物分析策略应根据药物的作用机制（mechanism of action，MOA）和开发阶段定制。对于 mAb 药物，用于分析药代/毒代动力学（PK/TK），药效动力学和免疫原性的分析方法通常分别为定量分析、“游离”和“总”药物浓度、“游离”和“总”靶标浓度、抗药物抗体（ADAs）和中和性 ADAs的开发和验证。对于具有复杂结构的抗体衍生物（antibody derivatives），衍生物的每个功能域可能需要额外的一组检测方法，从而可能导致测试方法的数量几何级增长。


     此外，与开发默认没有生物转化（biotransformation）的mAb相比，复杂的抗体衍生物更容易发生生物转化，这意味着可能需要另一组测试方法来描述复杂抗体药物的结构完整性及其生物转化后的各种产物（biotransformed variants）。


     配体结合式测试方法（LBA）是mAbs生物分析的主力军，同时液相色谱-质谱方法（LC-MS）也在近年越来越受欢迎。这两种分析技术也主要应用于抗体药物及其衍生物的生物分析。

 
     由于药物模式的复杂性，通常需要多个 LBA/LC-MS 分析方法。当每个分析方法都有特定的取样程序，而且并非所有的检测可以在一个生物分析实验室实施时，独特的样本采集、处理、储存、运输和分析条件，会造成复杂的后勤需求。因此，需要设计一种生物分析策略，用于表征双特异性分子的PK特性，并研究其体内结构-功能关系。本文提供了若干相关案例研究和监管层面的预测。

导论

    近年来，蛋白质工程和生产方面的进展推动着生物制药行业开发越来越复杂的蛋白质药物，其能够结合多个药物治疗靶标，故能够提高疗效和/或者减少剂量，用以降低毒性，使安全风险最小化，提高用药的方便性和依从性等。双特异性药物被定义为基于抗体（antibody-based）或基于框架（scaffold-based）的蛋白质药物，其包含一个以上的工程改造功能区域，该功能区域结合两个或多个独立的抗原靶点。本文集中关注双特异性药物的两个独特的功能域，其结合与疾病的发生和进展相关的蛋白质，而不考虑抗体骨（主）干（antibody backbone）的功能。


    开发双特异性生物药的领域，基于并发展了传统的单分子靶点的抗体免疫疗法的框架，正在蓬勃发展，以靶向协同的分子途径（target synergistic molecular pathways）来更有效地治疗疾病。两种双特异性抗体，blinatumomab（Blincyto）和catumaxomab（Removab）已经在美国或欧盟批准上市，用于肿瘤适应症的治疗；这证明了这类药物分子的应用价值。目前有60多种用于癌症和其它疾病的新型双特异性生物药正在临床开发之中。


双特异性生物药分子


     双特异性分子可以以各种不同的结构呈现，利用抗体可用的各种结合域。这些结合域包括可变重链(VH)、可变轻链(VL)、单链分子(ScFv)和/或抗体的Fc域，可以组合使用这些结构域，以结合多个分子靶标。具有多个Fab结合域的双可变域免疫球蛋白(dual-variable domain immunoglobulin，DVD -Ig)这样的大型免疫球蛋白分子和较小的串联ScFv结构域(diabody)，在分子大小和结构上代表了两个极端，它们都可通过各种蛋白质工程技术生产出来(图1)。

    图1. 双特异性分子的构造。本图展示了三个双特异性抗体的例子：1. Hetero-lg；2.双可变结构域/dual variable domain；3.antibody-peptibody；这些代表了不同的分子大小，结构及复杂性。



      目前的技术允许蛋白质结合域（protein binding domains）和抗体支架（antibody scaffolding）的多种组合，形成一系列独特的药物模式（drug modalities）。双特异性药物的几个功能类别包括：与可溶性靶标结合以抑制或刺激相关功能、与细胞靶标结合以拮抗或刺激相关功能、与细胞靶标结合以招募免疫细胞以促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)功能。


     对双特异性分子独特的结构和作用机制(MOA)给药代动力学和药理学(PK/PD)评估，体内结构-功能关系的确定以及临床前和临床药物开发阶段所需的生物分析支持带来了新的挑战。


双特异性抗体

     双特异性抗体是通过基因工程重组生产的抗体，由两个不同的结合域（two distinct binding domains）组成，能够结合两种不同的抗原或同一抗原的两个不同表位。它们可以分为两个主要类别，即带有或缺少Fc区域的两类。关于生物分析支持， FDA关于双特异性抗体开发的指南指出：可能需要开发多种PK定量方法，以定量总（total），结合（bound）和未结合（unbound）的双特异性抗体的浓度；也可能需要多个免疫原性测试方法，来测试对双特异性抗体不同结构域的免疫反应。

 
 
     由于双特异的性质，双特异性抗体的未结合或“游离”PK定量方法可以包括三个测定方法：一个双功能方法同时测定两个活性结合域（active binding domains）和两个单功能方法分别测定二个结合域中之一。双功能方法分别使用两个靶标蛋白作为捕获和检测试剂。单功能方法使用一个靶标蛋白作为捕获试剂，而使用抗人类IgG作为检测试剂。通常，在解释检测结果时应谨慎，因为单特异性方法缺乏特异性，故也能检测到双功能分子。


     双特异性抗体的定量PK分析方法面临生物转化（biotransformation）的重大挑战，因此，通常定制开发方法以定量某个功能域生物转化的程度。独特的双特异性构造可能造成意外的生物转化路径，并可能使PK行为复杂化。


双特异性生物药的PK/PD


    双特异性分子增加了PK建模的复杂性，例如，表征靶向介导的药物处置需要考虑两个靶点的表达，它们以不同的频率出现在不同的细胞类型上。“游离”药物浓度与“总”药物浓度的定量，对于PK/PD建模至关重要，特别是当涉及可溶性靶点时；但是，由于靶标蛋白在体内的不同表达模式（expression patterns），药物定量分析可能会变得更加复杂。在绝大多数的临床研究中，药物浓度是在所谓的“中央隔室central compartment”或系统循环（systemic circulation）中，以血浆或血清样本的形式，测定的，这在很大程度上是由于易于从服用药物的受试者中取样。根据几十年累积的科学数据，系统药物浓度（systemic drug concentrations）反映了药物在靶标作用部位的浓度。血液病是一个例外，但即使是血液病也通常含有固体组织的部分。系统药物浓度和作用地点（site-of-action）的药物浓度之间的关系会因作用地点的不同而不同，但适当的动物模型数据通常为人体状况提供了可靠的模型。

 
     由于药理学或药效学响应依赖于全身药物浓度，正确理解PK-PD关系对于预测达到预期响应的剂量和暴露量极为有用。同样重要的是，确定可能发生在每个独特的双特异性分子上的任何潜在的体内生物转化（in vivo biotransformation），并彻底表征不同的药物在暴露量和活性方面的差异。总体来说，这些表征有助于理解药物的暴露量-响应关系，并提供了，基于药物变构体活性，优化剂量设计方案。


    PK评估是非临床毒理学研究和临床开发的必然需求，在非临床疾病模型评估中也发挥着重要作用；一般在非临床疾病模型评估中，研究药物剂量-响应的特性，用以选择先导药物。非临床毒理学研究中的全身暴露量数据，可用于确定首次对人(FIH)研究的安全起始剂量，该起始剂量是基于此类安全研究确定的暴露量余量（exposure margin）。暴露量余量由未观察到不良反应水平(NOAEL)的动物暴露量与选定人体剂量的预期暴露量的比值确定，通常设定为比NOAEL预期的人体等效剂量(HED)低10倍。由于双特异性分子可靶向多种生理或病理途径，因而可能具有更强的药理和/或毒理学作用；故监管机构可能要求制药商使用“最低预期生物效应水平”（MABEL）模型来选择FIH剂量,这意味着需要比基于NOAEL更低的起始剂量。临床研究中较低的起始剂量，意味着可能需要提高PK方法的灵敏度；考虑到双特异性分子的复杂性，这可能是一个挑战。

 
PK定量分析方法

 
    为了支持符合药物预期用途的PK数据的可靠性和有效性，监管机构希望制药商，对所有的GLP研究/关键临床试验，使用经过验证的分析方法来定量药物浓度。监管部门为生物分析方法的验证提供了具体的指南，这些指南在全球各监管机构中普遍一致。这些指南文件清楚地阐明了对分析方法参数的性能及其可接受值的监管期望，包括收集，储存和分析过程中研究样本的完整性。关于检测试剂的讨论，特别是捕获和检测试剂的选择，分析格式和技术平台，以及用于PK表征和PK/PD相关性分析的相关待测物，都可以在科学文献中找到。对于靶标在血液循环中的药物（这些靶标可在血清或血浆样本中形成药物-靶标复合物），关于应当测定的最相关的药物形式(不包括生物转化物/ biotransformants)仍然存在争议:“总体”(结合了 + 未结合靶标的药物)或“游离部分”或“活性部分”(未结合靶标的部分)。关于总药物浓度和游离药物浓度的问题最好根据靶标的已知状况，药物的MOA和特征，项目团队的意见，技术可行性，以及监管反馈（如果需要的话），按个案处理的原则解决。最近有文献讨论了相关问题。


LBA定量方法


   生物分析策略的选择可以根据药物特定的开发阶段而有所不同。例如,在非临床物种中研究人类蛋白药物, 使用不与非人类物种交叉反应的，针对人类蛋白的试剂，特别是非人灵长类同源物，例如,重组人源化单克隆抗体（recombinant humanized monoclonal antibody，rhuMabs）,可以开发一种通用的，快速且经济的PK分析方法来测定总药物浓度，以支持全面的毒理学评价。然而,这种方法不能用在临床研究中,更加药物特异性试剂，例如，靶标抗体和anti-idiotypic抗体，更可能是必要的：使用通用试剂与内源性分子发生交叉反应会干扰蛋白药物浓度的定量，而测定游离药物的浓度与建立PK-PD关系息息相关。非临床和临床生物分析策略的另一个问题是，使用针对每个靶标结合位点（target binding site）的试剂，例如针对每个靶标结合域的靶标和/或anti-idiotypic抗体的组合，来测定完整的双特异性分子是否最有价值。

Anti-idiotypic 抗体

   当一种抗体与另一种抗体的idiotope结合时，它被称为抗idiotope抗体。抗体的可变部分，包括独特的抗原结合位点，被称为idiotope。Idiotopes内的表位组合对于每种抗体都是独一无二的(图2).由于目前开发的大多数单克隆抗体药物是人源的或人源化的，因此最可能诱导抗药物抗体（ADA）的免疫原性表位（immunogenic epitopes），存在于提供大多数结合接触面（binding contacts）的hypervariable complementarity determining regions（CDR）之内。可以生成抗idiotypic抗体，特异性地结合一个单克隆抗体药物。这些高度特异性的抗体可用于，以不同测试格式，开发药代动力学（PK）定量方法，以测定临床前和临床样本中的游离药或总药物的浓度，或在ADA测试中作为阳性对照等。

图2. 抗体idiotope：抗体可变区域的，独特的抗原决定因素（antigenic determinants）的集合。



    在这方面，药物的MOA在选择合适的分析方法时很重要，特别是在药物活性依赖于双特异性药物对两个靶点的同时作用的情况下。抗CD3/抗肿瘤靶标双特异性药物就是一个例子：测定完整的，有活性的双特异性分子是充分表征该药物的最佳策略。反之，如果药物活性依赖于一个靶点的参与，而另一个靶点的参与只是增强了药物活性, 那么，测定完整药物可能就不那么重要了；此时，只使用一种药物特异性试剂 (例如，单臂靶向/1-arm target，单臂/1-arm延长 PK或增加暴露量) 可能是合理的策略。另一种方法的一个例子是评估catumaxomab抗体的PK: 该PK分析方法利用了该抗体药物是小鼠/大鼠的嵌合结构体，使用了特异性的antispecies immunoglobulin的捕获/检测试剂。这里，使用了一个针对药物的嵌合结构的混合通用分析格式（mixed generic assay format）；该方法特异性来自嵌合结构，而不涉及CDRs。这种方法基于两个假设: 首先，单克隆抗体(mAb)药物在体内通常非常稳定。其次，靶标蛋白没有可检测到的可溶性形式。因此，该PK分析方法可以测定血液循环中游离的catumaxomab单抗，这是符合其预期用途的。一般来说，默认的生物分析策略是利用双特异性药物的双特异性，但需要认识到开发这样的试剂是耗时的和有挑战的；并且可能在药物发现甚至非临床研究阶段还没有这样的试剂。下面将更详细地考量各种选择。

PK定量方法的设计

完整双特异性分子的分析方法

 
    完整双特异性分子定量的目的是测定生物基质中完整的双特异性分子。该测试只测定有活性双特异性分子，其没有任何功能区域被抗药物抗体(ADA)或血液循环中的靶点切断（clipped off）或阻断（blocked）。完整分子的检测方法通常需要使用靶标抗体和/或anti-idiotypic抗体，以测定包含可结合捕获和检测试剂这两个功能域的分子。在评估体内或体外稳定性时(假设试剂可用)，建议采用完整分子的分析方法。完整分子定量的测试格式如图3A所示。

 
     这种测试格式使用两个靶标分子或两个完全中和性的anti-idiotypic抗体，或两者的组合。最近， LC-MS，结合affinity pull-down（使用靶标或anti-idiotypic抗体）以分离待测物，已用于表征的生物基质中的药物完整分子。Affinity pull-down是一种类似于免疫沉淀（immunoprecipitation）的小规模亲和纯化技术，只是抗体也可以被其它亲和系统所取代。

 
     这是一种sequential方法：首先，使用anti-idotypic抗体来下拉（pull down）双特异性药物的游离形式；然后，用LC-MS法进行定量。利用这种形式，可以确定双特异性分子的游离浓度。然而，在方法开发过程中需要考虑几个关键因素:

 
     该测试格式必须设计好，以避免潜在的空间位阻效应（steric hindrance）。一些双特异性分子被设计为靶向一个可溶性分子和一个与细胞结合的分子(细胞表面受体)。这种双特异性分子被明确设计为与两个靶点同时相互作用，以发挥其预期的药理活性。然而，双特异性分子和检测试剂在检测环境中可能有不同的相互作用，换句话说，在塑料容器表面可能表现出不同的相互作用。因此，应该理解和谨慎的处理空间位阻效应。例如，从位阻效应研究中收集的数据，例如，在Octet平台上考查域结合干扰（domain binding interferences）的数据，可能指向选择一个特定的捕获和检测顺序，以避免不必要的空间位阻效应;


     一些双特异性分子，通过协同作用，具有很高的药效学效力（highly pharmacologically potent），这可能意味着只需要非常低的临床剂量。因此, 基于已知的剂量-响应数据和剂量模型（dose modelling）的分析方法灵敏度将会是一个重要的考量指标;


     与传统的单特异性抗体相比，双特异性分子更有可能出现体内生物转化（biotransformation），即体内不稳定性（in vivo instability）。生物转化不仅可能影响双特异性分子的活性，而且还可能影响定量双特异性分子的可靠性。因此，完全中和性，anti-idiotypic抗体或靶标分子(图3A)有可能允许检测潜在的生物转化（consequential biotransformation）;

    图3. 用于定量双特异性分子的不同测试格式和试剂。(A)完整分子的测定方法：使用靶标蛋白X和靶标蛋白Y作为检测试剂，测定完整双特异性分子的浓度。(B) 功能域分析：采用抗Fc抗体和靶标Y蛋白作为检测试剂来测量功能域Y的浓度。(C)功能域分析：采用抗Fc抗体和X靶标蛋白作为检测试剂来测量功能域X的浓度。(D)总浓度测定方法：通过使用两种抗Fc抗体作为测试试剂来测定双特异性分子的所有可溶形式。

    与单特异性生物药分子类似，如常规的单克隆抗体，ADA可以通过阻断捕获或检测试剂与药物的结合来干扰对双特异性分子的定量(注意不要与改变的药物清除率相混淆)。此外，一个结构域可能是immunodominant；那么取决于测试格式，这可能会导致PK分析结果的差异。另外，也许除了内源性的IgG4分子之外，双特异性分子所固有的新颖，非天然结构，可能使双特异性分子比单特异性分子更容易诱发ADA反应，这是免疫原性风险评估的一个考虑因素。


功能域分析（functional domain assay）


     功能域分析是测定一个功能域的浓度，此格式可用于展示相关的单一功能域的浓度。当双特异性的MOA使得药物分子的一部分（a partial molecule）保留部分活性时(如可溶性靶标，融合蛋白，或肽激动剂)，这些检测显得尤为重要。功能域分析的目的是确定哪个功能域是有活性的，因此，可用于解释与ADA的形成或生物转化相关的功能丧失。


     单域测试格式的设计如图3B和3C所示。该方法特意使用药物靶标，或抑制性anti-idiotypic抗体来分析双特异性分子的游离结构域（free domain）， 并与抗Fc或抗框架（anti-framework）抗体，作为捕获或检测试剂，联用。这些分析方法可用于药物开发的任何阶段。有时，基于细胞的测试方法可以用于测量单个功能域，如blinatumomab情况。


     图3. 用于定量双特异性分子的不同测试格式和试剂。(A)完整分子的测定方法：使用靶标蛋白X和靶标蛋白Y作为检测试剂，测定完整双特异性分子的浓度。(B) 功能域分析：采用抗Fc抗体和靶标Y蛋白作为检测试剂来测量功能域Y的浓度。(C)功能域分析：采用抗Fc抗体和X靶标蛋白作为检测试剂来测量功能域X的浓度。(D)总浓度测定方法：通过使用两种抗Fc抗体作为测试试剂来测定双特异性分子的所有可溶形式。



总浓度分析方法（total assay）

 
     总体测定法（total assay）用于测定双特异性分子的所有可溶形式。这种测试格式可用于显示双特异性分子的存在，而不考虑任何结构或功能的变化。该分析方法通常用于测定蛋白质的主（骨）干（backbone）结构，如Fc结构域。但这可能并不适用于所有的构造；取决于构造的性质，也不一定适用于所有的分子变构体，例如，在临床研究中rhuMab双特异性药物。总体测定法应当耐受ADA和与靶标的结合（target binding）。图3D描述了总体测定法，其中两个与不同表位结合的抗人Fc抗体可以用作捕获和检测试剂。


 
    图3. 用于定量双特异性分子的不同测试格式和试剂。(A)完整分子的测定方法：使用靶标蛋白X和靶标蛋白Y作为检测试剂，测定完整双特异性分子的浓度。(B) 功能域分析：采用抗Fc抗体和靶标Y蛋白作为检测试剂来测量功能域Y的浓度。(C)功能域分析：采用抗Fc抗体和X靶标蛋白作为检测试剂来测量功能域X的浓度。(D)总浓度测定方法：通过使用两种抗Fc抗体作为测试试剂来测定双特异性分子的所有可溶形式。




    同样，单一多克隆抗人IgG试剂也可用作捕获和检测试剂。但此方法只用于非临床研究。对于测量总体药物浓度， LC-MS非常有用，特别是当没有特定的试剂可用时。总体测定法可与“完整intact”或“有效active”药物测定法，结合使用，或同时使用两者，以评估体内外（in vivo /ex vivo）的稳定性，以及生物转化（biotransformation）对结构-功能关系的影响，例如，某些deamidation或氧化反应可能破坏药物与靶标的结合。

 
   PK样本中生物环境的复杂性为使用哪一种定量方法增加了另一层挑战。生物分析方法的应用是从药物发现和临床前安全性评估期间的动物研究开始的，持续到临床开发，并延伸到上市后的生命周期管理(即附加适应症和/或组合疗法)。正如前面所指出的，不同的分析策略可以在不同的开发阶段使用；当体内结构-功能关系确立之后，可以在药物发现和开发的整个过程中开发和使用单一的定量分析方法。但是，需要对分析方法的生命周期管理有特殊考虑，以便将来自多个物种和不同目标患者群体的PK/PD知识整合到所探索适应症中去。

双特异性分子的方法验证和认证（method validation & qualification）


    对双特异性分子的方法验证和认证与其他大分子一样，包括精密度和准确度，稀释线性度，选择性，干扰和特异性，以及稳定性测试，以确保数据的稳健性和完整性。然而，由于双特异性分子的性质，如上所述，在开发完整分子的分析方法时，对这两个结构域的特异性和分析干扰的评估都是必要的。

特别声明

    本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊, 官方网络报道, 等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。

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